高灵敏度胰蛋白酶活性检测试剂盒(荧光法)

产品简介

 胰蛋白酶(Trypsin)，是胰脏分泌的一种丝氨酸肽链内切酶，可切割赖氨酸及精氨酸C末端形成的肽键。作为一种重要消化酶，胰蛋白酶广泛应用于蛋白质的酶解/测序、组织/细胞的消化、胰岛素的生产等各研究领域。胰蛋白酶能够催化底物水解，生成7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)，产物在Ex/Em=380/460nm可测量荧光强度，通过荧光强度(RFU)的变化即可表征胰蛋白酶的活性。本试剂盒可检测样品中的胰蛋白酶活性，也可以作为胰蛋白酶残留的活性评估。与传统的BAEE法或TAME法测定胰蛋白酶活性相比，本试剂盒具有更高的检测灵敏度。

 实验原理

胰蛋白酶活性测定试剂盒是一种胰蛋白酶裂解底物生成7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）的方法，在Ex/Em=380/460nm检测荧光强度（RFU），由于荧光强度与AMC含量成正比，因此可以准确地测定胰蛋白酶的活性。

组分说明

未提供的必需品

1. 具有Ex/Em=380/460nm荧光检测功能的酶标仪；

2. 移液器；

3. 蒸馏水或纯化水；

4. 水浴锅；

使用方法

试剂准备

1. 本试剂对水份敏感，在开瓶前，需将各组分小瓶于室温下平衡20min方可使用，以避免容器内的水份冷凝。

2. 设置酶标仪，Ex/Em =380/460nm 

3. 配制底物溶液：用1mL蒸馏水或纯化水复溶试剂B底物配制1mg/mL底物浓溶液，混合均匀，再加入1mL试剂A，充分混合均匀，如果使用不完，请分装密封保存在-20℃,一个月内可以正常使用。

4. 配制样品溶液：用试剂A稀释液配制样品溶液，推荐浓度为（2-100）ng/mL或（0.1-5）ng/孔（50μL）加样量。

5. 配制质控品溶液：取2μL质控品加入5998μL试剂A稀释3000倍。稀释后的质控品溶液须在4小时内使用。

6. 校准品的配制：校准品的配制：由于试剂C校准品中的DMSO在-20℃下呈固体，即使是在室温下也很难融化，因此需在使用试剂C前于37℃水浴中加热1-5分钟，使DMSO融化。然后按下述表格，将融化的试剂C和试剂A配制梯度浓度的校准品。注意：稀释后的标准品须在4小时内使用！每次使用都要重新稀释！

检测操作步骤

1.取所需数量的酶标板条固定于板架上；向孔中依次加入校准品（6个浓度）/底物溶液，50μL/孔，每个检测两个重复；

2.向每孔中加入试剂A/质控品/样品溶液，50μL/孔，充分混匀；加样可参考下表说明；

3.检测：Ex/Em=380/460nm，检测荧光强度（RFU）温度设置在25℃，立即计时，用动力学模式进行检测，每0.5min测一次。连续检测10分钟；

4.在线性范围内荧光强度的变化率应恒定，选择两个时间点（T1和T2），呈线性关系不得少于3分钟，来计算样品中的胰蛋白酶活性；

5.若变化率不能保持恒定，可用较低浓度另行测定。

结果分析与计算

1.在线性范围内（荧光强度的变化率应恒定），选择两个时间点（T1和T2），呈线性关系不得少于3分钟，来计算样品中的胰蛋白酶活性；

2.每个标准品和样品的重复读数取平均值；

3.将每个标准品的平均荧光强度作为AMC最终浓度的函数绘制出来；

4.计算样品活性：

1）S1是时间T1（min）时的样品荧光强度读数（RFU），S2是时间T2（min）时的样品荧光强度读数（RFU），M（mg）：每孔中含胰蛋白酶的质量；

2）由S1的荧光强度（RFU）根据AMC校准曲线，线性拟合推导出AMC的量C1（nmol），由S2的荧光强度（RFU）根据AMC校准曲线，线性拟合推导出AMC的量C2（nmol）；

3）质控品与样品溶液中胰蛋白酶的活性计算公式为：

胰蛋白酶活性（mU）=（C2(nmol)-C1(nmol)）/（T2(min)-T1(min)）

或

（mU/mg）=（C2(nmol)-C1(nmol)）/[（T2(min)-T1(min)）×M(mg)]

4）当样品的荧光强度（RFU）大于最高浓度的标准品荧光强度时应用试剂A稀释液进一步稀释样品，并重新分析。

结果的解释

1. 1U（AMC法）表示为胰蛋白酶在25°C下每分钟可以裂解底物产生1μmol的AMC(μmol/min)。

2. 1U（AMC法）=1.7U（BAEE法）

注1）酶活（BAEE法）定义：25℃，pH7.6,反应体系3.2mL（25px光路），每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个USP单位。注2）BAEE=N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐，分子式：C15H22N4O3.HCl

结果的换算

若已知样品的比活（每毫克酶所具有的酶活力，一般用U/mg表示），可由检测样品的活性推导残留的质量或浓度，举例如下：

已知检测结果：1mU/孔（AMC法），样品的比活：1mg=38000U（BAEE法），每孔体积50μL，可得：

1）检测结果的活性换算（每孔）：活性（AMC法）×1.7=活性（BAEE法），即：1mU（AMC法）=1.7mU（BAEE法）

2）检测结果的质量换算(每孔)：活性（BAEE法）/比活=1.7mU（BAEE法）/38000U=4.47×10-8mg=44.7pg

3）检测结果的浓度换算：浓度=每孔质量/每孔体积，即：44.7pg/50μL=0.894ng/mL

4）样品的浓度：若样品经过稀释，计算结果时，需将稀释后的样品浓度乘以稀释倍数。

检测的局限性

1.下列化学物质或生物材料会干扰检测，导致结果下降或完全失效，适当稀释样品会降低干扰的影响，用试剂A稀释液配制样品溶液，推荐浓度为（2-100）ng/mL或（0.1-5）ng/孔（50μL加样量）。

1）胎儿或小牛血清（作为细胞培养基的组分），会抑制胰蛋白酶的活性。

2）RIPA：含有SDS，可以破坏/降低酶的活性。

2.样品制备过程中，请勿使用蛋白酶抑制剂，避免干扰分析。

检测范围

0.002-1mU（AMC法）也可换算为0.0034-1.7mU（BAEE法）

注意事项

1.本试剂盒适合由合格的技术人员操作使用。

2.将试剂盒从冷藏或冷冻环境中取出并在室温下平衡20分钟后方可使用。

3.为了避免试剂、移液枪头和平板的交叉污染，应使用一次性的移液枪头和试剂容器。未用完的试剂不要重新倒回试剂瓶或试剂管中，注意不要把不同试剂瓶的盖子弄混而造成交叉污染。

4.本试剂盒中的试剂不能与其他批次或其他来源的试剂混合使用。

5.本试剂盒仅用于科研和生产过程控制，不能用于人类和动物的医学诊断。