高灵敏度胰蛋白酶活性检测试剂盒(荧光法)

  • 别名:
  • 编码:DDM1418A
  • 级别:
  • 简介:胰蛋白酶能够催化底物水解,生成7-氨基-4-甲基香豆素(AMC),产物在Ex/Em=380/460nm可测量荧光强度,通过荧光强度(RFU)的变化即可表征胰蛋白酶的活性。本试剂盒可检测样品中的胰蛋白酶活性,也可以作为胰蛋白酶残留的活性评估。与传统的BAEE法或TAME法测定胰蛋白酶活性相比,本试剂盒具有更高的检测灵敏度。
品牌 货号 包装规格 库存 价格 数量
Seebio DDM1418A-48T 48T 面议
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Seebio DDM1418A-96T 96T 面议
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基础信息

检测范围0.002-1mU(AMC法)也可换算为0.0034-1.7mU(BAEE法)
应用可检测样品中的胰蛋白酶活性,也可以作为胰蛋白酶残留的活性评估

产品介绍

产品简介

 胰蛋白酶(Trypsin),是胰脏分泌的一种丝氨酸肽链内切酶,可切割赖氨酸及精氨酸C末端形成的肽键。作为一种重要消化酶,胰蛋白酶广泛应用于蛋白质的酶解/测序、组织/细胞的消化、胰岛素的生产等各研究领域。胰蛋白酶能够催化底物水解,生成7-氨基-4-甲基香豆素(AMC),产物在Ex/Em=380/460nm可测量荧光强度,通过荧光强度(RFU)的变化即可表征胰蛋白酶的活性。本试剂盒可检测样品中的胰蛋白酶活性,也可以作为胰蛋白酶残留的活性评估。与传统的BAEE法或TAME法测定胰蛋白酶活性相比,本试剂盒具有更高的检测灵敏度。

 

 实验原理

胰蛋白酶活性测定试剂盒是一种胰蛋白酶裂解底物生成7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的方法,在Ex/Em=380/460nm检测荧光强度(RFU),由于荧光强度与AMC含量成正比,因此可以准确地测定胰蛋白酶的活性。

 

组分说明

组分

名称

48T

96T

保存条件

试剂A

稀释液

12.5mL

25mL

2℃-8℃

试剂B

底物

1mg(干粉)

1mg×2(干粉)

-20℃

试剂C

AMC标准品(0.1mM)

300μL

500μL

-20℃

试剂D

质控品

15μL

20μL

-20℃

组份E

黑色酶标板

一块

一块

R.T

 

未提供的必需品

1. 具有Ex/Em=380/460nm荧光检测功能的酶标仪;

2. 移液器;

3. 蒸馏水或纯化水;

4. 水浴锅;

 

使用方法

试剂准备

1. 本试剂对水份敏感,在开瓶前,需将各组分小瓶于室温下平衡20min方可使用,以避免容器内的水份冷凝。

2. 设置酶标仪,Ex/Em =380/460nm 

3. 配制底物溶液:用1mL蒸馏水或纯化水复溶试剂B底物配制1mg/mL底物浓溶液,混合均匀,再加入1mL试剂A,充分混合均匀,如果使用不完,请分装密封保存在-20℃,一个月内可以正常使用。

4. 配制样品溶液:用试剂A稀释液配制样品溶液,推荐浓度为(2-100)ng/mL或(0.1-5)ng/孔(50μL)加样量。

5. 配制质控品溶液:取2μL质控品加入5998μL试剂A稀释3000倍。稀释后的质控品溶液须在4小时内使用。

6. 校准品的配制:校准品的配制:由于试剂C校准品中的DMSO在-20℃下呈固体,即使是在室温下也很难融化,因此需在使用试剂C前于37℃水浴中加热1-5分钟,使DMSO融化。然后按下述表格,将融化的试剂C和试剂A配制梯度浓度的校准品。注意:稀释后的标准品须在4小时内使用!每次使用都要重新稀释!

 

序号

配制脓度(nmol/孔)

试剂C(μL)

试剂A(μL)

校准品1

0

0

150

校准品2

0.2

6

144

校准品3

0.5

15

135

校准品4

10

30

120

校准品5

2.0

60

90

校准品6

4.0

120

30

 

检测操作步骤

1.取所需数量的酶标板条固定于板架上;向孔中依次加入校准品(6个浓度)/底物溶液,50μL/孔,每个检测两个重复;

2.向每孔中加入试剂A/质控品/样品溶液,50μL/孔,充分混匀;加样可参考下表说明;

位置

 第一步加样(50uL/孔)

第二步加样(50μL/孔)

A1/A2

校准品1

试剂A

B1/B2

校准品2

试剂A

C1/C2

校准品3

试剂A

D1/D2

校准品4

试剂A

E1/E2

校准品5

试剂A

F1/F2

校准品6

试剂A

G1/G2

底物溶液

质控品

H1/H2

底物溶液

样品溶液

 

3.检测:Ex/Em=380/460nm,检测荧光强度(RFU)温度设置在25℃,立即计时,用动力学模式进行检测,每0.5min测一次。连续检测10分钟;

4.在线性范围内荧光强度的变化率应恒定,选择两个时间点(T1和T2),呈线性关系不得少于3分钟,来计算样品中的胰蛋白酶活性;

5.若变化率不能保持恒定,可用较低浓度另行测定。

 

结果分析与计算

1.在线性范围内(荧光强度的变化率应恒定),选择两个时间点(T1和T2),呈线性关系不得少于3分钟,来计算样品中的胰蛋白酶活性;

2.每个标准品和样品的重复读数取平均值;

3.将每个标准品的平均荧光强度作为AMC最终浓度的函数绘制出来;

4.计算样品活性:

1)S1是时间T1(min)时的样品荧光强度读数(RFU),S2是时间T2(min)时的样品荧光强度读数(RFU),M(mg):每孔中含胰蛋白酶的质量;

2)由S1的荧光强度(RFU)根据AMC校准曲线,线性拟合推导出AMC的量C1(nmol),由S2的荧光强度(RFU)根据AMC校准曲线,线性拟合推导出AMC的量C2(nmol);

3)质控品与样品溶液中胰蛋白酶的活性计算公式为:

胰蛋白酶活性(mU)=(C2(nmol)-C1(nmol))/(T2(min)-T1(min))

(mU/mg)=(C2(nmol)-C1(nmol))/[(T2(min)-T1(min))×M(mg)]

4)当样品的荧光强度(RFU)大于最高浓度的标准品荧光强度时应用试剂A稀释液进一步稀释样品,并重新分析。

 

结果的解释

1. 1U(AMC法)表示为胰蛋白酶在25°C下每分钟可以裂解底物产生1μmol的AMC(μmol/min)。

2. 1U(AMC法)=1.7U(BAEE法)

注1)酶活(BAEE法)定义:25℃,pH7.6,反应体系3.2mL(25px光路),每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个USP单位。注2)BAEE=N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐,分子式:C15H22N4O3.HCl

 

结果的换算

若已知样品的比活(每毫克酶所具有的酶活力,一般用U/mg表示),可由检测样品的活性推导残留的质量或浓度,举例如下:

已知检测结果:1mU/孔(AMC法),样品的比活:1mg=38000U(BAEE法),每孔体积50μL,可得:

1)检测结果的活性换算(每孔):活性(AMC法)×1.7=活性(BAEE法),即:1mU(AMC法)=1.7mU(BAEE法)

2)检测结果的质量换算(每孔):活性(BAEE法)/比活=1.7mU(BAEE法)/38000U=4.47×10-8mg=44.7pg

3)检测结果的浓度换算:浓度=每孔质量/每孔体积,即:44.7pg/50μL=0.894ng/mL

4)样品的浓度:若样品经过稀释,计算结果时,需将稀释后的样品浓度乘以稀释倍数。

 

检测的局限性

1.下列化学物质或生物材料会干扰检测,导致结果下降或完全失效,适当稀释样品会降低干扰的影响,用试剂A稀释液配制样品溶液,推荐浓度为(2-100)ng/mL或(0.1-5)ng/孔(50μL加样量)。

1)胎儿或小牛血清(作为细胞培养基的组分),会抑制胰蛋白酶的活性。

2)RIPA:含有SDS,可以破坏/降低酶的活性。

2.样品制备过程中,请勿使用蛋白酶抑制剂,避免干扰分析。

 

检测范围

0.002-1mU(AMC法)也可换算为0.0034-1.7mU(BAEE法)

 

注意事项

1.本试剂盒适合由合格的技术人员操作使用。

2.将试剂盒从冷藏或冷冻环境中取出并在室温下平衡20分钟后方可使用。

3.为了避免试剂、移液枪头和平板的交叉污染,应使用一次性的移液枪头和试剂容器。未用完的试剂不要重新倒回试剂瓶或试剂管中,注意不要把不同试剂瓶的盖子弄混而造成交叉污染。

4.本试剂盒中的试剂不能与其他批次或其他来源的试剂混合使用。

5.本试剂盒仅用于科研和生产过程控制,不能用于人类和动物的医学诊断。

 


质量指标

MSDS

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