腺病毒滴度快速测定试剂盒

腺病毒(Adenovirus)是无囊膜的线性双链DNA病毒，在自然界分布广泛。腺病毒载体是继逆转录病毒载体后被广泛应用的转基因载体，现已经被广泛应用于动物细胞的基因转染和基因治疗等。在腺病毒的试验中，腺病毒滴度对于保持样品之间的一致性和实现正确的表达水平是非常重要的，因此我们经常需要测量腺病毒滴度。传统的终点稀释试验需要两周，周期较长，本试剂盒可在48h内快速进行腺病毒滴度的测定，检测结果较为准确。

实验原理

腺病毒可以感染并在AD-293/HEK-293细胞中复制，由于腺病毒感染HEK293细胞后可表达六邻体蛋白（腺病毒基因组编码的衣壳蛋白）,因此可以通过感染的细胞中的病毒六体蛋白的表达量来检测病毒的载量。本试剂盒包含抗六邻体蛋白的特异性抗体，用于识别感染细胞，经过辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗放大信号，并加入辣根过氧化物酶的底物DAB进行染色，使被病毒感染的阳性细胞变成深棕色。通过计算给定区域内深棕色/黑色细胞的数量来确定感染细胞的滴度水平，每个染色细胞对应一个感染单位(single infectious unit,ifu)。

本检测方法可与1型、2型、5型和6型人腺病毒相兼容，目前已经对基于5型人腺病毒进行了验证。

产品组成

未提供的必需品

1.磷酸盐缓冲液(PBS,pH:7.4)

2.磷酸盐缓冲液+1%牛血清白蛋白(PBS+1%BSA)

3.12/24孔培养板

4.恒温培养箱(加湿，5%CO₂)

5.显微镜(×20倍物镜)

6.细胞计数器

7.细胞培养基(如：DMEM+10%胎牛血清+抗生素)

8.甲醇

使用方法

为了最大限度地提高准确度，每次稀释的病毒应一式两份检测。选取没有病毒的孔作为阴性对照，滴度实验所用感染时间应与后续实验所用感染时间一致。

感染细胞

1在培养板中每孔加入1mL健康的对数期AD-293或HEK 293细胞（12孔板：5×105/mL/孔；24孔板：2.5×105/mL/孔），使用标准培养基，如DMEM+10%FBS+抗生素，确保细胞均匀分布于孔中，以便准确测定滴度，理想情况下，细胞在感染前传代不应超过6次。

2用PBS或培养基为稀释液将病毒原液进行10倍系列稀释，稀释比例为10-2至10-6；

3在两个相对应的组织培养孔（步骤1中制备）中分别加入每种病毒稀释液；

4培养细胞24-48小时（37℃,5%CO₂）；

5轻轻地抽吸将培养基从细胞中去除。

6将培养皿置于罩内孵育5-10分钟，使其干燥。

固定与染色

1、加入预冷的100%甲醇固定细胞

2、在-20℃下孵育10分钟

3、抽吸液体，用PBS+1%BSA溶液仔细洗涤细胞3次

4、从培养板孔中吸出溶液。然后每孔加入试剂A溶液。37℃孵育1小时，在振荡器上摇匀

5、重复操作3

6、从培养板孔中吸出液体。然后每孔加入试剂B溶液。37°℃孵育1小时，在振荡器上摇匀

7、配制1×DAB工作液：取出试剂C,用试剂D 10倍稀释试剂C(1:9)

8、重复操作3

显色并计数

1在培养板中每孔加入1×DAB工作液

2室温孵育15分钟，或在4°C下孵育过夜，颜色可以增强。

3吸出液体，每孔加入PBS溶液

4使用显微镜（×20倍物镜），随机选择至少三个区域进行计数，并且计数的区域应包含5-50个阳性（深棕色/黑色细胞），得出阳性细胞的平均值，若区域内的阳性细胞数较少（5-10个），并假设感染细胞孔中随机分布，建议您选取更多的区域(例如6-10个计数，以达到相同的准确度。

5计算每孔的感染单位（ifu/mL）=阳性细胞数（区域）×区域数（孔）/病毒样本体积(mL)x稀释倍数

注意事项

1.将试剂C底物DAB (10×)保存在-20℃或以下。若要使用该溶液，请取出使用所需的量，并立即将其放回-20℃。请勿将溶液平衡到室温

2.若所有细胞呈阳性(棕色/黑色)则考虑：

1)冲洗步骤不充分；

2）腺病毒原液稀释不正确或不充分；

3)试剂B稀释不正确；

4)DAB工作液配制不正确；

5)没有用PBS+1%BSA溶液仔细洗涤细胞3次。

3.若细胞单层在固定步骤中被破坏或脱落则考虑：

1)小心移动培养板，以尽量减少对细胞单层的干扰；

2)当加入或吸取溶液时，轻轻地将移液器移到孔的一侧，而不是直接移到细胞上，以防止破坏细胞单层；

3)对病毒原液稀释的不足可能导致细胞脱离培养皿。

本试剂盒仅用于科研和生产过程控制，不能用于人类和动物的医学诊断。