有木有增加蛋白表达量的转染试剂？ ——试试Seebio®小西家的阳离子聚合物PEI

专题推荐 | 2023-08-01

CHO细胞和HEK-293细胞常用于哺乳动物瞬转系统中快速生产优质的蛋白。然而，研究者在利用瞬时转染生产重组蛋白时，通常会遇到蛋白表达量极低，成本高昂且操作复杂不利于放大生产等问题。优质的转染试剂是通往优质蛋白生产瞬转平台的必经之路。

自1996年开始阳离子聚合物作为基因转染载体的研究，聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）作为化学转染的新宠，近年来倍受关注，无论是科研还是在工业化、大规模瞬时转染表达重组蛋白或病毒载体领域都是使用广泛的转染试剂。西宝生物开发的新一代阳离子聚合物产品着重优化和DNA结合能力。为了更好的了解PEI这款阳离子聚合物产品，本文从PEI的分类，原理，使用及常见问题及产品推荐几个方面介绍该产品。

PEI的分类

PEI的结构可以写成是-(CH2CH2NH)_n-。根据合成原料与工艺的差异，产物有支链PEI与直链PEI的差异，2者在应用上存在比较明显的偏好。支链PEI在力学性、加工性、成膜性、薄膜透光性方面更具有优势，广泛应用于造纸、石油、轻纺、建筑等领域，而直链PEI在真核细胞的基因转染方面更具有优势，已广泛应用于基因转染方面。

直链PEI，应用最广泛的主要有PEI25000与PEI40000（也有称PEIMAX），在HEK293和CHO等细胞中转染效率较高。PEI 40000与PEI 25000转染试剂相比，具有很多优点。包括：

1.溶解性：PEI 40000较易溶解，可直接在水中溶解，PEI 25000需要先把水调成弱酸性助其溶解，溶解后再用NaOH把pH调至中性；

2.操作性：PEI 40000操作简便，更易于使用，且比PEI 25000的转染效果好；

3.稳定性：PEI 25000含有4-11%的丙酰基残留，其能阻止聚合物主链与DNA结合。相较于PEI 25000，PEI 40000是完全脱落的结构，因此其性能始终高效如一。

PEI转染的原理

阳离子聚合物转染的共同原理：聚合物把DNA包裹形成复合物，防止被DNase降解，然后附着在细胞膜上被内吞进入胞内，破裂释放后，DNA进入细胞质中，从而发挥一定的功能。阳离子聚合物和阳离子脂质体的主要区别在于其不含疏水部分而完全溶于水，并可以方便地进行化学修饰。

直链PEI单体中每3个原子含1个氮，形成胺基。每相隔二个碳原子，即每第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的质子海绵(proton sponge)体。这是PEI有较强的结合DNA和黏附细胞，能作为基因转导载体的重要原因。针对这个特点西宝生物开发的新一代阳离子聚合物产品着重优化和DNA结合能力。

图1. pH值与质子化关系（源自：doi.org/10.1021/acs.macromol.0c01501）

PEI 能将 DNA 包裹成带正电荷的微粒，这些微粒可以黏合到带有负电荷的细胞表面残基，并通过胞吞作用进入细胞。一旦进入细胞，胺的质子化导致反离子大量涌入以及渗透势降低，在低pH环境中实现DNA胞内释放。普遍被接受的观点是PEI上未质子化的胺可以在与膜结合的细胞器（如溶酶体）中吸收氢离子，这将导致更多氢离子的流入，诱发渗透溶胀。而质子化胺之间的排斥引起PEI构象的改变，上述变化导致的渗透膨胀使囊泡释放聚合物与 DNA 形成的复合物进入细胞质。复合物拆解后，DNA 能自由的融合到细胞核中。

图2. PEI转染原理 (选自Current Protocols in Chemical Biology 9:147–157, September 2017)

产品优势

1.转染效率高：适合转染DNA，细胞密度在70%~80%时，转染效率可以达到80%以上；

2.应用范围广：既适用于HEK293等真核贴壁细胞的转染也适用于悬浮细胞的转染，并且适用于有血清和无血清的转染条件。

3.蛋白表达量高：少量的转染试剂获得高产量的蛋白表达，性价比高，适用于大规模的转染。

4.无机试剂，无动物源成分

5.低毒性：转染细胞形态良好并表达大量的目的蛋白；

6.产品稳定，质控严格；

不同细胞系参考数据以48孔板为例（数据仅供参考）

细胞类型	培养体系	转染时细胞汇合度	DNA	Seebio PEI（1mg/mL）
293H	DMEM	70-80%	0.2ug	0.2uL
293FT	DMEM	70-80%	0.2ug	0.6uL
293E	DMEM	70-80%	0.2ug	0.6uL
293F	DMEM	70-80%	0.2ug	0.6uL
COS7	DMEM	70-80%	0.2ug	0.6uL
hela	DMEM	70-80%	0.2ug	0.6uL
CaCO₂	MEM	70-80%	0.2ug	0.9uL
BHK21	MEM	70-80%	0.2ug	0.6uL
RAW264.7	DMEM	70-80%	0.2ug	0.6uL
SW480	IMDM	70-80%	0.2ug	0.6uL
MDCK	DMEM	70-80%	0.2ug	1uL
CHO-K1	IMDM	70-80%	0.2ug	1uL
HepG2	DMEM	70-80%	0.2ug	0.6uL
A549	DMEM	70-80%	0.2ug	0.6uL
NIH/3T3	DMEM	70-80%	0.2ug	0.9uL
Vero	DMEM	70-80%	0.2ug	0.9uL
sf9	SIM SF	70-80%	0.2ug	0.9uL

不同培养体系参考值

培养皿	表面积(cm²)	培养基总量	DNA的量(ug)	转染试剂的量(uL)	稀释液体积(uL)
96孔板	0.3	100uL	0.1	0.3	10
48孔板	0.7	200uL	0.2	0.6	20
24孔板	1.9	500uL	0.5	1.5	50
12孔板	3.8	1mL	1	3	100
6孔板	10	2 mL	2	6	200
25cm²培养瓶	21	4 mL	4	12	400
75cm²培养瓶	58	10 mL	10	30	1000

转染中的常见问题

1.转染效率低

原因：(1)细胞活力：使用活力好传代小于15代的细胞。

(2)细胞接种密度高/低：适当降低/增加接种密度。

(3)PEI/DNA比率不合适：进行不同基因转染时应对PEI和DNA的比例进行优化，以达到合适比例。

(4)质粒片段较大：可根据实际实验需要调整，如适当增加转染质粒总量等。

(5)混合方式不当：质粒DNA和PEI溶液混合时避免涡旋。同时要注意PEI加入 DNA溶液中的顺序。

2.细胞毒性高

原因：(1)转染液孵育时间过长：过长时间 PEI/DNA 复合体会导致细胞毒性。

(2)细胞接种密度低：适当增加接种密度。

(3)PEI/DNA比例高：优化合适的PEI和DNA的比例。

3.转染效果不稳定，重复性不好

原因：转染效果不稳定一般与两个因素紧密相关，一个是转染试剂的稳定性，另一个是基因的稳定性。转染试剂应按照说明书建议的保存温度及条件进行保存。溶解后则不建议反复冻融。如短时间内连续使用，可放置于4℃保存。若超过10天不使用，不建议使用。

产品选择指南

目前西宝生物（Seebio）提供了多种形式的转染试剂，客户可根据转染核酸的种类/贴壁细胞/悬浮细胞等条件，选择合适的转染试剂。具体选择指南如下：

产品种类	核酸类型	细胞类型	是否可替换
Seebio®聚乙烯亚胺PEI（Polyethylenimine）转染试剂 (货号：AJL0940C)	DNA	贴壁细胞悬浮细胞	可替换lipo3000，jet PEI
线性PEI转染试MW25000(货号：AJL0115C)	DNA	贴壁细胞悬浮细胞	可替换PEI 25KTM(23966)
线性PEI转染试剂(速溶型)MW40000(货号：AJL0940B)	DNA	贴壁细胞悬浮细胞	可替换PEI MAX 40K(24765)

订购信息

即用型

品牌	货号	产品名称	规格
Seebio	AJL0940C	Seebio®聚乙烯亚胺PEI（Polyethylenimine）转染试剂	1ml
			10ml
			50ml
			100ml

粉末非即用型

Seebio	AJL0940B	Seebio®线性聚乙烯亚胺，MW40000	10mg
			100mg
			1g
Seebio	AJL0115C	Seebio®线性聚乙烯亚胺， MW25000	1g

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WAKO	299-72603	D-PBS(-),Powder	10L
WAKO	168-23191	Penicillin-Streptomycin Solution（×100）青霉素-链霉素溶液（×100）	100mL
WAKO	164-25251	Penicillin-Streptomycin Solution（×50）青霉素-链霉素溶液（×50）	100mL

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产品编号	产品名称	产品说明	规格
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ABM0205B	SeeHEK293CD01基础培养基(干粉)	(无动物源，化学成分限定,不含水解物，含微量生长因子)	10L
			100L
ABM0206A	SeeHEK293CD02基础培养基(液体)	(无动物源，化学成分限定,不含水解物和生长因子)	1L
ABM0206B	SeeHEK293CD02基础培养基(干粉)	(无动物源，化学成分限定,不含水解物和生长因子)	10L
			100L
ABM0210A	SeeHEK293CD03基础培养基(液体)	原始培养基已经含有4mM Gln	1L
ABM0210B	SeeHEK293CD03,基础培养基(干粉)	原始培养基已经含有4mM Gln	10L
			100L
ABM0211A	SeeHEK293FM01补料培养基(液体)	液体补料A含有60g/L的葡萄糖，补料B不含葡萄糖	1L+100ml
ABM0211B	SeeHEK293FM01补料培养基(干粉)	液体补料A含有60g/L的葡萄糖，补料B不含葡萄糖	10L+1L
			100L+10L
EBM0209A	Seebio®条件培养液(293T)	含有细胞分泌物的培养液	10ml
			250ml

WAKO BalanCD 无血清细胞培养基

cGMP级别
可以提供液体及粉末形式
无血清
已取得DMF
化学成分限定
适应小试剂放大

HEK293系列：基因治疗病毒载体生产，蛋白瞬时表达 - 重组蛋白生产

货号	产品名称	规格
91165-1L	BalanCD HEK293 BalanCD HEK293培养基	1L
94137-10L		10L
94137-100L		100L
91166-500ML	BalanCD HEK293 Feed BalanCD HEK293补料	500mL
981444-10L		10L
981444-100L		100L

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WAKO	196-13401		100g
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