1.项目背景    

1.1临床意义    

摘自《25-羟基维生素D检测试剂注册技术审查指导原则》

维生素D是一种脂溶性类固醇衍生物，是人体必需的脂溶性维生素，经紫外线照射后可转化为维生素D2。人体从食物摄入或在体内合成的胆固醇经转变为7-脱氢胆固醇并贮存于皮下，经紫外线照射后可转化为维生素D3。维生素D主要有维生素D3（胆钙化甾醇）和维生素D2（麦角钙化甾醇）两种形式。其水平受很多因素的影响，主要包括紫外线辐射、膳食补充、年龄和肥胖、种族和民族因素等。维生素D本身不具有生物活性，需要发生2次羟基化转化为生物活性形式。第1次羟基化发生在肝脏，产生25-羟基维生素D，第2次羟基化主要发生在肾脏，产生具有生物活性代谢物1,25-二羟维生素D。当1,25-（OH）2D足量时，它可进一步在肾脏转化为24,25-（OH）2D，最后发生分解代谢。循环中的25-羟基维生素D的半衰期为2-3周。

因此，在医学上，对血液中25-羟基维生素D的检测经常被用于确定体内维生素D的含量，血液中25-羟基维生素D的浓度被认为是体现人体维生素D状态的最佳指标。

1.2小分子双抗体夹心法    

2015年公开专利CN104969067A《维生素D的测定方法及测定用试剂盒》提及小分子夹心法，摘抄部分内容如下。

使用抗体作为具有维生素D亲和性的物质的情况下，可以进一步使用二抗。作为二抗，可以为维生素D的抗体（一抗）的一抗部分的抗体，也可以为维生素D及一抗的复合物的抗体。二抗等抗体可以与检测用物质连接。

2024年公开专利CN117871874A《小分子物质免疫检测方法》对小分子夹心法的反应原理做了详细阐述，摘抄部分内容如下。

本发明提出了一种小分子物质免疫检测方法，其特征在于，包括：（1）将含有小分子物质的样本、配体、第二抗体和表面活性剂进行反应，得到小分子物质-配体-第二抗体三元复合物，且所述小分子物质-配体-第二抗体三元复合物中小分子物质诱导配体形成至少一个新的构象表位，所述第二抗体可特异性结合所述至少一个新的构象表位，所述表面活性剂可消除所述第二抗体与构象未改变的配体之间的结合；（2）检测所述小分子物质-配体-第二抗体三元复合物。

样本中的小分子物质与配体发生特异性结合，得到小分子物质-配体复合物，并且小分子物质-配体复合物中小分子物质诱导配体形成至少一个新的构象表位。小分子物质-配体复合物与第二抗体和表面活性剂反应，第二抗体特异性地与形成新构象表位的配体结合，同时也会与构象未改变的配体产生弱结合。表面活性剂可消除第二抗体与构象未改变的配体之间的结合，得到小分子物质-配体-第二抗体三元复合物。通过检测三元复合物，可以实现小分子物质检测。由此，采用双抗体夹心法可以提高检测准确性和灵敏度，不同浓度梯度样本检测区分度高。同时，减少了筛选高特异性复合物抗体的难度，更有利于小分子物质检测试剂盒的大规模生产和检测，应用价值高。    

2. 性能表现    

针对25-羟基维生素D抗原的检测（夹心法），西宝生物推出2种抗体及3种解离剂。

25-羟基维生素D抗体（货号：ECY4531B）识别抗原抗体复合物；    

25-羟基维生素D抗体（货号：ECY4531C）识别小分子抗原。    

具体性能如下（以下评估仅代表在西宝生物的工艺体系下的验证，建议客户根据自身工艺进行更为详细的验证）。

2.1化学发光（AE）平台    

组合1：25-羟基维生素D抗体（货号：ECY4531B）包被羧基磁珠+25-羟基维生素D抗体（货号：ECY4531C）标记吖啶酯；    

线性范围：1.5ng/mL-150ng/mL；最低检出限：1.5ng/mL。

2.2化学发光（AP）平台    

组合2：25-羟基维生素D抗体（货号：ECY4531B）包被羧基磁珠+25-羟基维生素D抗体（货号：ECY4531C）标记碱性磷酸酶；    

线性范围：1.5ng/mL-150ng/mL；最低检出限：1.5ng/mL。

2.3荧光免疫层析平台    

组合3：25-羟基维生素D抗体（货号：ECY4531C）标记荧光微球+25-羟基维生素D抗体（货号：ECY4531B）划膜；    

线性范围：5ng/mL-100ng/mL；最低检出限：5ng/mL。

3.临床相关性    

3.1化学发光（AE）平台：    

3.1.1 西宝生物发光（AE）平台25-羟基维生素D抗体配对组合1与质谱法赋值的临床样本相关性R2>0.95，相关性良好；

3.1.2西宝生物发光（AE）平台25-羟基维生素D抗体配对组合1与罗氏诊断的25-羟基维生素D试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2在0.90左右，相关性较好。

3.2化学发光（AP）平台：    

3.2.1西宝生物发光（AP）平台25-羟基维生素D抗体配对组合2与质谱法赋值的临床样本相关性R2在0.95左右，相关性良好；

3.2.2西宝生物发光（AP）平台25-羟基维生素D抗体配对组合2与罗氏诊断的25-羟基维生素D试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2＞0.90，相关性较好。

   

   

3.3荧光免疫层析平台：    

西宝生物荧光免疫层析平台25-羟基维生素D抗体配对组合3与罗氏诊断25-羟基维生素D试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2＞0.90，相关性较好。

   

4. 测试方案    

4.1化学发光（AE）平台-抗体配对组合1    

样本:样品加样量10ul；

试剂1：25-羟基维生素D抗体（货号：ECY4531B）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；

试剂2：25-羟基维生素D抗体（货号：ECY4531C）标记-吖啶酯稀释物，用量50ul/测试；

试剂3：25-羟基维生素D解离液（发光专用1）（货号：DCH0207B）/25-羟基维生素D解离液（发光专用2）（货号：DCH0207A）

注释：25-羟基维生素D解离液（发光专用1）（货号：DCH0207B）对质谱法赋值临床样本效果较好；    

25-羟基维生素D解离液（发光专用2）（货号：DCH0207A）对罗氏诊断（电化学发光法）赋值临床样本效果较好；    

反应条件：    

第一步：10ul样本+50ul试剂1+50ul试剂2+80ul试剂3混合，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入预激发液及激发液，进行测试。

测试使用发光仪器:科斯迈SMART 500S。    

4.2化学发光（AP）平台-抗体配对组合2：    

样本:样品加样量10ul/20ul；

试剂1：25-羟基维生素D抗体（货号：ECY4531B）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；

试剂2：25-羟基维生素D抗体（货号：ECY4531C）标记-碱性磷酸酶稀释物，用量50ul/测试；

试剂3：25-羟基维生素D解离液（发光专用1）（货号：DCH0207B）/25-羟基维生素D解离液（发光专用2）（货号：DCH0207A）

注释：25-羟基维生素D解离液（发光专用1）（货号：DCH0207B）对质谱法赋值临床样本效果较好；    

25-羟基维生素D解离液（发光专用2）（货号：DCH0207A）对罗氏诊断（电化学发光法）赋值临床样本效果较好；    

反应条件：    

第一步：10ul/20ul样本+50ul试剂1+50ul试剂2+80ul试剂3混合，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入底物，进行测试。

测试使用发光仪器:迎凯Shine i2900。    

4.3荧光免疫层析平台抗体配对组合3：    

样本:加样量10ul；

反应条件：10ul样品+100ul 25-羟基维生素D解离液（荧光层析专用）（货号：DCH0207C）混匀（无需等待解离），上样，反应时间（10min-15min）；

测试使用荧光仪器:和迈FIC-S100。

5.产品信息    

目前，由于维生素D检测的标准化工作刚刚起步，各种检测方法间存在着明显的结果差异，尤其是商业化方法以及不同实验室的自建方法。

1.液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）作为小分子检测的金标准，虽然特异性好、准确度高，但其通量小、前处理复杂、对设备和人员要求高，更重要的是出报告时间超过6小时，且无法当天出报告，因此难以广泛使用。

2.主流化学发光厂家检测维生素D的主要方法还有竞争法。

3.双抗夹心法相较于竞争法在灵敏度、特异性和检测范围均有明显优势，使用小分子夹心法检测维生素D近年得到了厂商和临床端越来越多的认可。

西宝生物作为体外诊断上游原料供应商，除上述新开发的夹心法抗原抗体试剂原料，还能提供竞争法相关试剂.详情如下：